Микробиологическая диагностика туберкулеза

Микробиологическая диагностика туберкулеза, общие вопросы

Одним из наиболее достоверных методов диагностики туберкулеза является микробиологическая диагностика, т.е. бактериологическое исследование патологического материала на наличие в нем размножающихся микобактерий туберкулеза (МБТ).

Микробиологическая диагностика считается наиболее точным методом диагностики туберкулеза, поскольку одно обнаружение возбудителя заболевания в больном органе или в секретах, которые он продуцирует, может однозначно ответить на вопрос о причине его поражения.

Дело в том, что такие тесты, как проба Манту, Диаскин-тест, Т-SPOT, квантифероновый тест, ИФА оценивают ответ иммунной системы на возбудителя туберкулеза и говорят о его присутствии в организме, но не позволяют отличить состояние носительства МБТ от состояния заболевания туберкулезом.

Если человек является здоровым носителем МБТ, это означает то, что его иммунная система еще справляется с инфекцией и не дает развиваться заболеванию. Это состояние не всегда требует назначения противотуберкулезных препаратов. А если препараты назначить необходимо- то в режиме химиопрофилактики.

Активное размножение МБТ в организме, взывающее заболевание, требует назначения развернутого лечения, иначе туберкулез будет неуклонно развиваться, что может привести к утрате функции пораженного органа и даже к смерти.

Легочные (и некоторые внелегочные) формы туберкулеза находят свое отражение на рентгенограмме легких и других видах рентгенологического исследования. Однако  рентгенологические проявления туберкулеза в ряде случаев бывают сходными с таковыми при нетуберкулезных заболеваниях, что требует применение дополнительных методов исследования для уточнения диагноза.

Обнаружение же МБТ в патологическом материале однозначно говорит о наличии заболевания туберкулез, требующего лечение.

Однако не все так просто. В некоторых случаях концентрация МБТ в органе достаточная, чтобы вызвать заболевание, но недостаточная для обнаружения в продуцируемом органом секрете.

В некоторых жидкостях и тканях организма МБТ появляются кратковременно и могут быть не обнаружены в момент проведения исследования.

Наконец, существуют «закрытые» формы туберкулеза, когда МБТ в силу анатомических особенностей пораженного органа, просто не попадают в продуцируемые наружу выделения.

Поэтому обнаружение МБТ в патологическом материале практически всегда говорит в пользу диагноза туберкулез, а отсутствие- не всегда его исключает.

Задачи микробиологической диагностики туберкулеза

Различные аспекты микробиологической диагностики туберкулеза освещены и регламентированы в следующих нормативных документах:

• Приказ Минздрава России от 21.03.2003 N 109 (ред. от 05.06.2017) «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»;
• Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 29 декабря 2014 г. № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания»;
• Клинические рекомендации «туберкулез у взрослых», Российское общество фтизиатров, 2021;
• Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 15 ноября 2012 г. N 932н «Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи больным туберкулезом».

 В целом микробиологическая (бактериологическая, лабораторная) диагностика туберкулеза решает задачи:

• Обнаружение МБТ в патологическом материале для подтверждения диагноза и определения степени заразности человека,
• Определение чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам,
• Определение типа МБТ для выяснения, действительно ли у человека туберкулез или другое заболевание, вызванное МБТ.

Патологический материал для исследования на микобактерии туберкулеза

Патологическим материалом, в котором могут быть обнаружены МБТ, является:

1. Мокрота (при поражении легких, бронхов, внутригрудных лимфоузлов),
2. Промывные воды бронхов (их забирают при проведении процедуры фибробронхоскопии), слизь из гортани (при поражении легких, бронхов, внутригрудных лимфоузлов),
3. Промывные воды желудка (исследуют при поражении легких, бронхов, внутригрудных лимфоузлов у меленьких детей, которые не умеют откашливать мокроту и заглатывают ее),
4. Моча (при поражении почек, мочеточников, мочевого пузыря, мочеполовой системы в целом),
5. Кал (при поражении кишечника),
6. Менструальная кровь, соскобы из матки (при поражении женских половых органов),
7. Спинномозговая жидкость (при поражении головного и спинного мозга),
8. Плевральная жидкость (при поражении плевры – оболочки легких),
9. Жидкость из полости перикарда (оболочки сердца) при ее поражении,
10. Синовиальная жидкость (жидкость из сустава) при поражении сустава,
11. Асцитическая жидкость (при поражении органов брюшной полости и скоплении в ней жидкости),
12. Кровь (только у ВИЧ-инфицированных больных в период распространения МБТ с током крови по организму (так называемая генерализация туберкулеза) – в этом случае информативен только метод ПЦР),
13. Гной и гнойно-некротические массы – при наличии гнойных ран и свищей (при любых формах легочного и внелегочного туберкулеза, осложнившегося этими образованиями),
14.  Резецированные органы, соскобы синовиальных оболочек, биопсийный материал лимфоузлов и других органов, который можно забрать на исследование во время операций и различных диагностических манипуляций (при самых различных локализациях поражения),
15. Трупный материал (в случае смерти).

Подготовка мокроты для микробиологической диагностики туберкулеза

Поскольку чаще всего люди заболевают туберкулезом легких, то исследуют на наличие МБТ обычно мокроту. Для того, чтобы анализ был достоверным и в диагностический материал не попали микроорганизмы из полости рта (сапрофиты), внешне напоминающие МБТ, перед сбором мокроты необходимо провести подготовку. Анализ сдается натощак.

Пациент должен почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Для увеличения ценности анализа  мокрота берется не менее 3 раз.

Собирают мокроту для микробиологической диагностики туберкулеза в специальную медицинскую стерильную посуду с закрывающейся крышкой.

 При малом количестве мокроты ее можно собирать несколько раз в течение суток в одну банку с хранением в холодильнике при температуре 4 – 8 ºС.

Мокрота должна быть исследована в течение 2-3 часов. При невозможности исследования мокроты в тот же день мокрота хранится в холодильнике при температуре 4 – 8 ºС  не более 3 суток.

При отсутствии мокроты врач может назначить проведение раздражающей ингаляции, которая вызовет кашель с мокротой. Проводится раздражающая ингаляция  подогретым до 42-45 градусов раствором из смеси 150г соли и 10г соды на 1 литр дистиллированной воды. Ингалируют 30-60 мл этого раствора в течение 10-15 минут, после этого появляется кратковременный кашель с отхождением мокроты, которую можно сдать на анализ.

При заборе на исследование мочи для микробиологической диагностики, для достоверности анализа, также нужно соблюсти определенные правила: забор производится после туалета наружных половых органов. В стерильную посуду с закрывающейся крышкой берется либо первая утренняя, либо средняя часть из утренней порции мочи

Моча доставляется в лабораторию в течение 2-3 часов после забора.

Методы микробиологической диагностики туберкулеза

Методы микробиологической диагностики, применяемые в поликлиниках и нетуберкулезных стационарах

Исследование при помощи микроскопии с окраской по Циль-Нильсену

Микроскопия с окраской по Циль-Нильсену – это метод микробиологической диагностики, заключающийся в окрашивании патологического материала специальными красителями (карболовым фуксином и метиленовым синим) и в последующем просмотре мазка, сделанного из этого материала, под обычным световым микроскопом. К достоинствам метода относится простота и дешевизна, что позволяет производить его в лаборатории любого лечебного учреждения. Поэтому для исследования мокроты этим методом достаточно обратиться в поликлинику по месту жительства (прикрепления), где его сделают бесплатно. Метод является быстрым – выявить МБТ можно в течение часа.

К недостаткам метода относится его малая разрешающая способность: в препарате можно обнаружить единичные МБТ, если в 1 мл материала содержится не менее 10000-100000 микробных тел. Т.е. МБТ можно обнаружить в материале, если их очень много.

Этот метод хорош при подозрении на распространенные и открытые формы легочного туберкулеза, а так же для уточнения статуса бактериовыделения: т.е. определения степени заразности человека для окружающих.

Более точные методы микробиологической диагностики используются при невозможности поставить диагноз на уровне учреждений общей лечебной сети (в поликлинике или в нетуберкулезном стационаре). Тогда пациента с заболеванием, подозрительным на туберкулез, направляют для дальнейшего обследования в противотуберкулезный диспансер, где ему можно провести исследования более дорогими и более точными способами. При наличии направления из поликлиники эти исследования в противотуберкулезном диспансере так же производятся бесплатно.

Методы, применяемые в противотуберкулезном диспансере

Исследование патологического материала при помощи люминесцентной микроскопии

Этот метод  микробиологической диагностики основан на способности жиров в составе МБТ воспринимать люминесцентные красители и затем светиться  при облучении ультрафиолетовыми лучами. Заключается в специальной флюорохромной  окраске материала, который просматривается под люминесцентным микроскопом. Такой микроскоп относится к дорогостоящему оборудованию и имеется только в противотуберкулезных учреждениях. Метод так же относится к быстрым, результат будет известен в течение нескольких часов. Информативность метода выше, чем метода микроскопии с окраской по Цилю-Нильсону на 9-19%.

Методы посева на питательные среды, общие характеристики

Это посев на питательные среды патологического материала и выращивание колоний микроорганизмов в термостате.

Метод очень точный, с высокой разрешающей способностью: он позволяет выявить МБТ, если в патологическом материале находится несколько микробов.

Но по скорости диагностики этот микробиологический метод относится к медленным. МБТ – это медленно размножающиеся микроорганизмы, поэтому и видимые колонии на питательных средах они образуют долго.

В настоящее время существует две разновидности метода с разной скоростью роста, они коротко будут описаны ниже. Следует отметить, что эти методы не заменяют, а взаимно дополняют друг друга и окончательное решение о наличии или отсутствии МБТ в патологическом материале принимается только по получении результатов обоих разновидностей.

Методом посева на твердую среду определяют степень массивности бактериовыделения: оно считается скудным, если на среде вырастает менее 20 колоний, умеренным – если колоний отт20 до 100 и массивным при числе колоний более 100.

Метод посева используют для определения чувствительности МБТ к лекарственным препаратам, как это делается – описано ниже.

Метод посева на плотные питательные среды

Образцы мокроты, которые пациент  сдает на анализ, предназначенный для микробиологической диагностики в противотуберкулезном диспансере, обязательно исследуется этим методом.

Для посева используют не менее двух белковых питательных сред в пробирках. Обработанная мокрота «засевается» на них и помещается в термостат на 3 месяца (это максимальный срок образования колоний).

Просмотр пробирок осуществляют каждую неделю. Ожидается появление небольших твердых колоний нескольких миллиметров в диаметре, по виду напоминающих цветную капусту.

Чаще всего появление колоний отмечается только к исходу первого месяца. Однако суждение об отсутствии роста колоний принимается по истечении всего трехмесячного срока.

Метод посева на жидкую питательную среду (метод BACTEC)

Один из образцов мокроты, сданный пациентом в противотуберкулезном диспансере, исследуется этим методом. Материал помещается в жидкую питательную среду, которая устанавливается в автоматизированную систему BACTEC. Система способна улавливать изменение цвета индикатора, помещенного в пробирку со средой, при поглощении кислорода растущими микробами.

Этот способ значительно уменьшает время определения роста МБТ, которое в среднем составляет 11 дней при максимальном времени ожидания в 33 дня.

Этот микробиологический метод используется и для выявления МБТ в патологическом материале, и для диагностики лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам. Для этого лекарственное вещество добавляют в питательную среду, в которую помещают патологический материал с МБТ, и проверяют наличие роста колоний в контрольные сроки. Отсутствие роста говорит о чувствительности МБТ к препарату.

Сам характер методики определяет время получения результата исследования на чувствительность к противотуберкулезным препаратам: при посеве на твердые среды – это, как минимум, 2 месяца, поскольку нужно сначала получить рост колонии на твердой среде, в потом «пересеять» ее на среду с препаратом и снова выждать не менее месяца. При посеве на жидкую среду срок уменьшается до 11-33 дней. Поэтому фтизиатры обычно начинают лечение по стандартным схемам, в которые входят препараты, наиболее подходящие пациенту в данной клинической ситуации.

При получении данных о лекарственной чувствительности МБТ схема соответственно меняется.

Необходимо отметить, что тестовые системы для исследования чувствительности методом BACTEC  в настоящее время разработаны не ко всем препаратам.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) на туберкулез

ПЦР на туберкулез – это метод, основанный на обнаружении типичных фрагментов ДНК микобактерий туберкулёза. Выполняется с помощью аппарата ДНК-амплификатора, в котором производят разгонку патологического материала на белковые фракции и выделяют ДНК, специфичную для молекулы МБТ. Затем производится удвоение или умножение этой ДНК.

Данные сведенья передаются на компьютер и выдается положительный или отрицательный результат.

Плюсом метода является скорость-результат можно получить в течение часа.

Метод в настоящее время считается обязательным для уточнения диагноза туберкулеза. Его делают из одного из образцов мокроты, который сдает пациент в противотуберкулезном диспансере, бесплатно.

В ряде нетуберкулезных лабораторий это  тест также производят, в них исследование может быть платным.

Поскольку в исследовании определяют не живую МБТ, а фрагмент ДНК, то метод нуждается в интерпретации врачом-фтизиатром, который оценит и другие диагностические данные.

Для ряда пациентов (например, при ВИЧ-инфекции) обнаружение ДНК МБТ методом ПЦР по диагностической значимости приравнивается к обнаружению «целой» МБТ.

При помощи метода можно определить генетические мутации, кодирующие лекарственную устойчивость МБТ к некоторым противотуберкулезным препаратам. Иными словами, при туберкулезе ПЦР позволяет установить лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам в течение часа, что делает его приоритетным среди других методов микробиологической диагностики туберкулеза. Однако, из-за его дороговизны соответствующее оборудование устанавливается только в противотуберкулезных учреждениях.

В противотуберкулезных диспансерах обычно есть ПЦР-анализаторы GeneXpert  MTB/RIF, определяющие наличие лекарственной устойчивости только к одному противотуберкулезному препарату – рифампицину. Этого бывает достаточно, чтобы выбрать правильное направление лечения, поскольку в настоящее время считается доказанной генетическая связь лекарственной устойчивости к рифампицину с устойчивостью к изониазиду. Поэтому при определении устойчивости к рифампицину методом GeneXpert фтизиатром делается выбор в пользу схемы лечения, применяющейся при  туберкулезе с устойчивостью к этим двум наиболее активным противотуберкулезным препаратам.

Тест-системы типа Genotype MTBDRs, определяющие лекарственную устойчивость методом ПЦР к целому ряду препаратов, установлены только в крупных НИИ туберкулеза.

Методы посева и метод ПЦР используют так же для идентификации МБТ, т.е. для определения их вида – типирование МБТ. МБТ могут вызывать не только туберкулез.

Ряд МБТ (так называемые атипичные МБТ, например МБТ battey, kansasii, xenopi, fortuitum) могут вызывать у человека нетуберкулезные заболевания – микобактериозы. Они по течению очень напоминают туберкулез, но отличаются меньшей заразностью, развиваются, в основном, у людей с иммунодефицитом и поддаются лечению препаратами, отличными от противотуберкулезных.

Различить микобактериоз от туберкулеза можно только при помощи микробиологической диагностики.

Методом ПЦР так же можно определить принадлежность возбудителя к вакцинному штамму МБТ. Это исследование делается при подозрении на осложнение вакцинации БЦЖ и производится тоже в крупных НИИ туберкулеза.

Если у Вас остались вопросы, Вы можете задать их здесь.